التصبيغ النسيجي(Histological staining)

 تصبيغ الانسجة Histological Stains

التصبيغ النسيجي(Histological staining) عبارة عن سلسلة من العمليات التقنية التي يتم إجراؤها في تحضير عينات الأنسجة عن طريق التلوين باستخدام البقع النسيجية للمساعدة في دراسة المجهر. تستغرق عملية التلوين النسيجي خمس مراحل رئيسية تتضمن ؛التثبيت(fixation) والمعالجة(processing) والتضمين(embedding) والتقسيم sectioning والتصبيغstaining.

يشير تاريخ علم الأنسجة إلى حدوث تغييرات كبيرة في التقنيات المستخدمة للتلوين النسيجي من خلال فحوصات الكيمياء والبيولوجيا الجزيئية والتقنيات المناعية ، والتي يشار إليها مجتمعة باسم الكيمياء النسيجية(histochemistry). استخدم علماء الأنسجة الأوائل المواد الكيميائية المتوفرة بسهولة لإعداد الأنسجة للدراسات المجهرية ؛ كانت هذه المواد الكيميائية المختبرية عبارة عن ثنائي كرومات البوتاسيومpotassium dichromate والكحول وكلوريد الزئبق mercuric chloride لتصلب الأنسجة الخلوية. كانت تقنيات التلوين المستخدمة هي الكارمين carmine، نترات الفضة silver nitrate، الجيمساGiemsa ، بقع الترايكرومrichrome Stains ، صبغة غرام Gram Stain والهيماتوكسيلين Hematoxylinوغيرها. لا تزال العديد من إجراءات البقع قيد الاستخدام حتى اليوم ، وقد تم استبدال العديد من الإجراءات الأخرى بتقنيات التلوين المناعي immunostaining, والجزيئي وغير المزروع non-culture وغيرها من التقنيات المتقدمة الأخرى. وقد سهلت إلى حد كبير دراسة الأعضاء والأنسجة.تم التخلي عن بعض طرق التصبيغ لأن المواد الكيميائية المطلوبة ثبت طبيا أنها سامة. أشارت دراسات الحالة إلى أنه في علم الأنسجة الحديث ، يتم استخدام مزيج من تقنيات الصبغ المختلفة لتعزيز فعالية عملية التصبيغ.

جوانب محددة من مرضيات الانسجة Histopathology

أولاً: التصبيغ Staining

يستخدم التصبيغStaining لإبراز السمات المهمة للأنسجة وكذلك لتعزيز تباين الأنسجة. الهيماتوكسيلين Hematoxylin صبغة أساسية تُستخدم بشكل شائع في هذه العملية وتلطيخ النواة وتعطيها لونًا مزرقًا بينما يوزين eosin تلطخ نواة الخلية مما يعطيها صبغة وردية. ومع ذلك ، هناك العديد من تقنيات التلوين الأخرى المستخدمة لخلايا ومكونات معينة. لتلوين هو عملية طبية شائعة الاستخدام في التشخيص الطبي للأورام حيث يتم تطبيق لون الصبغة على الحدود الخلفية والأمامية لأنسجة العينة لتحديد موقع الخلايا المريضة أو الورمية أو الخلايا المرضية الأخرى. في الدراسات البيولوجية ،  في بعض الحالات ، يتم استخدام العديد من طرق التلوين المتعددة مثل التلوين التفريقي differential staining أو التلوين المزدوج double staining أو التلوين المتعدد multiple staining .

ثانياً : التثبيت fixation

في علم الأنسجة ، يشير التثبيت fixation  إلى استخدام المواد الكيميائية للحفاظ على بنية الأنسجة الطبيعية والحفاظ على بنية الخلية من التدهور. في الغالب ، يتم استخدام الفورمالين (neutral buffered formalin)في هذه الحالة عند استخدام مجهر ضوئي لإجراء الدراسة. تعمل المثبتات على تعزيز الحفاظ على الأنسجة والخلايا من خلال عملية لا رجعة فيها من خلال البروتينات المترابطة cross-linking proteins. ومع ذلك ، في حين أن العملية تعمل على الحفاظ على بنية الخلية لغرض الدراسات النسيجية ،فقد وجد أنها تدمر وتفسد البروتينات مما يجعلها غير فعالة. تثبيت الفورمالين يفسد الحمض النووي DNA, miRNA وانسجة Mrna .

                                       

لذلك يجب الاسراع في اجراء عملية التثبيت تفادياً لحدوث التغيرات التي تطرأ على النسيج بعد انفصاله عن جسم الكائن الحي وموت خلاياه, وهذه التغيرات تسمى "تغيرات مابعد الموت" وهي اذا تركت العينات النسيجية في الهواء,فانها تجف وتتقلص بسبب فقدانها للمحتوى المائي بعملية التبخر Dehydration , اذا وضعت العينات النسيجية في محلول ذو تركيز معين , فانها سوف تخضع لظاهرة الانتفاخ الاسموزي Osmatic Swelling او التقلص الاسموزي Osmatic shrinkage , تتعرض للتفسخ التعفني Microbial putrefaction  وهو تحطم وتفسخ الخلايا والانسجة بسبب انتشار وتكاثر البكتريا والفطريات بافراز خمائرها لتحلل مكونات الخلايا, وتؤدي الى تعفنها وتحطمها , التحلل الذاتي Autolysis وهو تحلل وتفسخ الخلايا بفعل الخمائر Enzymes  التي تتحرر من الجسيمات الحالة Lysosomes الموجوده في سايتوبلازم الخلية بشكل طبيعي, حيث تبدأ هذه الجسيمات الحالة بعد موت الخلية بالانفجار وتحرير خمائرها داخل نفس الخلية مما يؤدي الى تحلل مكونات الخلية الداخلية وتحولها الى وسط هلامي متجانس ليس له معالم محددة. وهذه الخمائر والتي تعرف بمجموعة الـ Cathepsin وجدت اصلاً لبناء

جزيئات البروتين من الاحماض الامينية, وهي تقوم بعد موت الخلاى يا بعمل عكسي حيث تقوم بتحطيم البروتين الذي يكون معظم اجزاء الخلية وتحوله الى احماض امينية.

تهدف عملية التثبيت الى قتل الخلايا الحية وتحويلها الى حالة الصلابة, وايقاف تغيرات مابعد الموت لذلك يجب اختيار محلول يستطيع منع الجفاف او الانتفاخ او التقلص , وكذلك يقوم بقتل البكتريا والفطريات ومنع انتشارها, ويوقف كذلك نشاط انزيمات التحلل الذاتي , ويعرف مثل هذا المحلول بالحافظ Preservative , اما المحلول المثبت Fixative , فهو بالاضافة لكونه محلولاً حافظاً يمتاز بخصائص اضافية تجعله قادراً على تهيئة النسيج لمقاومة العديد من المعاملات الكيميائية اللاحقة التي قد تتلف العينات النسيجية مثل عملية التجفيف Dehydration ,او الاشباع والطمر بشمع البارافين الساخن. وزيادة قابلية سطوح الانسجة لتقبل الصبغات والتلون بها , وزيادة معامل الانكسار Refractive index لاجراء الخلية مما يسهل  تمايزها ووضوحها تحت المجهر Microscope , وتحويل مكونات الخلية من حالة شبه السيولة الى الصلابة دون تغيير في شكل وحجم هذه المكونات. ولاجراء عملية التثبيت بالشكل المناسب , يجب اختيار المثبت الذي يحقق اكبر قدر من هذه الخصائص, وبشكل عام عند اختيار المثبت المناسب يجب ان يكون المحلول المثبت له القدرة على تحقيق الاهداف التالية:

1.       التغلغل السريع داخل النسيج وقتل الخلايا فوراً ولتقليل اثر تغيرات مابعد الموت الى اكبر حد ممكن.
2.    ان يحافظ على العلاقات التركيبية بين اجزاء النسيج ومكونات الخلايا في صورة اقرب ماتكون الى صورتها وهي حية.
3.     العمل على تصلب النسيج وتحويل سايتوبلازم الخلايا من حالة شبه السيولة الى حالة الصلابة عن طريق تخثر البروتينات المكونة للخلايا.
4.      زيادة تقبل سطوح الانسجة للصبغات, وذلك بايجاد فروقات بين معاملات الانكسار لاجزاء الانكسار.

هناك عدد من المثبتات قيد الاستخدام, ولكن مثبتات الفورمالديهايد(formaldehyde) هي الأكثر استخدامًا. يعمل الفورمالين neutral buffered formalin NBF على استقرار الأحماض الأمينية في البروتينات ويوفر الأنسجة الجيدة والحفاظ على بنية الخلية. البارافين – الفورمالين paraformaldehyde- PFA فعال في التصبيغ المناعي immunostaining ولكنه يتطلب تحضيره حديثًا لتعزيز فعاليته. ثبت أن مثبت Bouin فعال في الأنسجة الرقيقة والحساسة مثل الأنسجة الصغيرة والجنينembryo  وأنسجة المخ . يوفر مثبت Bouin حفظًا جيدًا للنواة nuclei والكلايكوجين  glycogen  ، لكن اختراقه بطيء ويشوه الميتوكوندريا mitochondria وأنسجة الكلىkidney.

التجفيف Dehydration: في هذه الخطوة ، الهدف هو إزالة الماء من الأنسجة المختارة لتصلبها وتسهيل قطع الشرائح الرقيقة ، بحيث تكون أكثر رقة لاستخدامها في المجاهر الضوئية وسميكة للميكروسكوب الإلكتروني. تتم إزالة الماء من الأنسجة من خلال طريقة التجفيف من خلال الإيثانول  ethanol . تتكرر العملية من خلال مادة تنقية كارهة للماءhydrophobic clearing substance مثل الزيلين xylene لإزالة الكحول وشمع البارافينparaffin wax  وعامل التشريب infiltrated agent.

الطمر او لأدماج Embedding

تتم عملية الادماج باستخدام شمع البارافين paraffin wax لتعزيز سهولة استخراج التراكيب الخلوية وتهيئة النسيج لعملية القطع. في الأنسجة الخلوية المعقدة ،يتم استخدامplastic resin or wax أو تستخدم مجموعات من المثبتات لإنتاج شكل جيد. ومع ذلك ، قد تؤدي هذه المثبتات إلى تدهور تراكيب الخلايا والأنسجة بسبب التسخين لفترات طويلة ، وقد يؤدي ذلك إلى مشاكل عند إجراء عملية التهجينhybridization  الناتجة عن الحمض النووي الريبي RNAغير المستقر. في نفس الخط ، يؤدي تسلل شمع البارافين إلى تثبيط اختراق الأجسام المضادة والمثبتات الكيميائية الأخرى. للتخفيف من هذه المشكلة ، فإن تجميد الأنسجة بعد الادماج وإزالة الشمع بعد التصبيغ staining واستخدام مثبتات PFA يوفر حلاً موثوقًا به.

  

 التقطيع Sectioning

حتى يتم دراسة المقاطع النسيجية تحت المجهر الضوئي يجب ان تكون رقيقة, بحيث يخترقها الضوء . ويتم الحصول على المقاطع الرقيقة بواسطة جهاز يعرف بجهاز القطع Microtome   . في هذه الحالة ، يتم قطع سلسلة من الأنسجة الرقيقة ذات السماكة المطلوبة وتحضيرها بطريقة البارافين paraffin method.

استرجاع المستضدات  Antigens Retrieval : هذه هي العملية التالية بعد التثبيت fixation والادماج embedding التركيز على استرجاع المستضدات التي تم حجبها. عند استخدام مثبتات الفورمالينformalin  بالإضافة إلى تثبيتات الألدهيدaldehyde  الأخرى ،يؤدي الارتباط المتبادل للبروتينات إلى إخفاء مواقع المستضد ،وهذا يؤدي إلى تصبيغ كيميائي مناعي immunohistochemical أضعف. عمل عملية استرجاع المستضد على كسر الروابط المتقاطعة للبروتين والكشف عن الحواتمepitopes (الجزء من جزيء المستضدantigen  الذي يرتبط به الجسم المضادantibody)  والمستضدات antigens التي تم إصلاحها ودمجها باستخدام الفورمالين والبارافين. تتمثل الإستراتيجية العامة في تحسين كثافة تصبيغ الأجسام المضادةantibodies.

تقنيات استرجاع المستضد شائعة الاستخدام من خلال طرق الاسترجاع الناتجة عن الحرارة  heat-induced والمحللة للبروتين proteolytic. يجب أن تأخذ عملية التحلل البروتينيproteolysis digestion process أقل وقت ممكن لتجنب الإفراط في الهضم الذي قد يفسد بنية الأنسجة والحواتم epitopes. تؤدي طريقة الحرارة إلى إزالة البروتين الطبيعي وفي بعض الحالات يتم فقد المستضدات. قد يؤدي التسخين إلى عكس التعديلات الكيميائية chemical modificationsالتي تحدث أثناء فترة التثبيت. يؤدي التسخين من أجهزة مثل أجهزة الميكروويف إلى تفاعلات كيميائية لبنية البروتين. ومع ذلك ، فإن مجموعة من الأساليب الأنزيميةenzymatic  واسترجاع الحرارة heat retrievalتؤدي إلى كثافة تصبيغ فعالة.

تحضير الأنسجة للتلطيخ

قبل أن يتم تصبيغ الأنسجة وعرضها ،يجب تحضيرها بحيث يمكن قطع قسم رفيع جدًا ،بسمك خلية واحدة فقط ، ووضعه على شريحة مجهرية. يتضمن هذا تثبيتfixing  الأنسجة حتى لا تتحلل ثم تصلبها hardening وتدعمهاsupporting  بحيث يمكن قصها إلى الأجزاء الرقيقة جدًا المطلوبة هناك طريقتان رئيسيتان مستخدمتان لهذا الغرض ، يشار إليهما بالمقاطع المجمدة frozen sectionsوالأقسام المضمنة بالبارافين paraffin-embedded sections. تُستخدم الأقسام المجمدة Frozen sectionsعند الحاجة إلى إجابات سريعة ، عادةً أثناء الجراحة حيث يحتاج الجراح إلى معرفة طرف الاستئصال عند إزالة الورم. إنها سريعة الإنتاج ،ولكنها عادة لا تنشئ نفس جودة المقطع مثل تقنية البارافين.

عملية تحضير المقطع المجمد frozen section هي كما يلي:

1.            يتم تجميد الأنسجة بسرعة للحفاظ عليها وتقويتها.
2.      يتم تقسيم الأنسجة المجمدة في جهاز القطع microtome في غرفة التجميد freezing chamber ويوضع على شريحة مجهر للتلوين.
3.          يتم إصلاح القسم على الفور قبل أن يبدأ في التحلل ثم يتم تلطيخه.

عندما يتم تحضير أقسام البارافين paraffin sections، يتم حفظ العينة أولاً بمثبتfixative ثم يتم دعم بنية الأنسجة عن طريق تشريب infiltrating العينة بشمع البارافين  paraffin wax.  تستغرق العملية وقتًا أطول من إنشاء أقسام مجمدة frozen sections، ولكنها توفر تلطيخًا أفضل جودة في معظم الحالات ويمكن تخزين العينات الناتجة إلى أجل غير مسمى تقريبًا.

تكون عملية قسم البارافينparaffin section process  كما يلي:

التثبيت يحافظ على الأنسجة (عادة باستخدام محلول يعتمد على الفورمالديهايد).

Grossing يعزل منطقة معينة من الأنسجة المراد قطعها.

يسمح الدمج Embedding بتوجيه العينة ويؤمن العينة في كتلة من الشمع لقص المقطع وتخزينه.

تستخدم معالجة الأنسجة Tissue processingسلسلة من الكواشف لتحل محل بيئة مائية (قائمة على الماء) ببيئة كارهة للماءhydrophobic ، مما يتيح تشرب عناصر الأنسجة بشمع البارافين  paraffin wax.

يتم إجراء التقسيم على جهاز microtome  يقطع مقاطع دقيقة جدًا يتم تعويمها في حمام مائي ثم يتم التقاطها ووضعها على شرائح مجهرية.

تُجفف الشرائح بعد ذلك في فرن أو على طبق ساخن لإزالة الرطوبة ومساعدة الأنسجة على الالتصاق بالشريحة.

النسيج الموجود على الشريحة جاهز الآن للتلوينstaining.

خطوة الأولى للتلوين هي إزالة الشمع التي تستخدم مذيبًا لإزالة الشمع من الشريحة قبل التلوين. يتم ذلك دائمًا كجزء من عملية التلوين. عندما يكتمل التصبيغ ، يتم تغطية الجزء بزجاج غطاء يجعل التحضير دائمًا.

لماذا التصبيغ بــH&E هو أمر روتيني

يستخدم تلطيخ الهيماتوكسيلينHematoxylin  والأيوزينEosin  (H&E) بشكل روتيني في مختبرات التشريح المرضي لأنه يوفر لأخصائي علم الأمراض / الباحث عرضًا تفصيليًا للغاية للأنسجة. يحقق ذلك من خلال تلطيخ تراكيب الخلايا بوضوح بما في ذلك السيتوبلازم والنواة والعضيات والمكونات خارج الخلية. غالبًا ما تكون هذه المعلومات كافية للسماح بتشخيص المرض بناءً على تنظيم (أو عدم تنظيم) الخلايا ، كما تُظهر أي تشوهات أو مؤشرات معينة في الخلايا الفعلية (مثل التغيرات النووية التي تُرى عادةً في السرطان). حتى عند استخدام طرق تصبيغ متقدمة ، لا تزال بقعة H&E تشكل جزءًا مهمًا من الصورة التشخيصية لأنها تعرض مورفولوجيا الأنسجة الأساسية التي تسمح لأخصائي علم الأمراض / الباحث بتفسير البقعة المتقدمة بشكل صحيح.

في مختبر الأنسجة السريرية ، يتم تلطيخ جميع العينات مبدئيًا بـ H&E ولا يتم طلب البقع الخاصة أو المتقدمة إلا إذا كانت هناك حاجة إلى معلومات إضافية لتوفير تحليل أكثر تفصيلاً ، على سبيل المثال للتمييز بين نوعين متشابهين شكليًا من السرطان.

نظرًا لحجم تلطيخ H&E المطلوب ، تستخدم معظم المختبرات السريرية أنظمة اوتماتيكية بالكامل وأصبح التلوين اليدوي نادرًا الآن.

الـــــــــــمصادر

محمود الطردة..وآخرون,- اساسيات علم التحضير النسيجي. -عمان:- دار الثقافة,-2000.

 Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., & Mohammedsaleh, Z. M. (2015). Histological Stains: A Literature Review and Case Study. Global journal of health science, 8(3), 72–79. https://doi.org/10.5539/gjhs.v8n3p72.

   Anderson J. An introduction to Routine and special staining. 2011.

(Retrieved on August 31,2020 from).

http://www.leicabiosystems.com/pathologyleaders/an-introduction-to-routine-and-special-staining .