طرق تحليل الحمض النووي (nucleic acids)
الأحماض النووية
(nucleic acids) هي بوليمرات
حيوية موجودة في جميع الكائنات الحية ، حيث تعمل على تشفير الجينات ونقلها والتعبير
عنها. تسمى هذه الجزيئات الكبيرة بالأحماض النووية لأنه تم تحديدها لأول مرة داخل نواة
الخلايا ، الأحماض النووية عبارة عن جزيئات تسمح للكائنات الحية بنقل المعلومات الجينية
(genetic information) من جيل إلى
آخر. هناك نوعان من الأحماض النووية: حمض النووي الرايبوزي منقوص الاوكسجين deoxyribonucleic
(المعروف باسم DNA) وحمض النووي الرايبوزي ribonucleic
(المعروف باسم RNA). تتكون الأحماض النووية من مونومرات النوكليوتيدات
المرتبطة ببعضها البعض. تحتوي النيوكليوتيدات على ثلاثة أجزاء: قاعدة نيتروجينية(Nitrogenous Base) قاعدة نيتروجينية. قواعد DNA النيتروجينية: Adenine ، Guanine
، Cytosine ، Thymineو قواعد RNA : Adenine ، Guanine
، Cytosine ، و Uracil
وسكرخماسي الكربون ومجموعة فوسفات.
يتضمن تحليل الحمض
النووي بشكل عام عزل وتوصيف(isolation
and characterization) عينة DNA أو RNA ذات الاهتمام. تعتبر تنقية
العينات وتقييم الجودة من الخطوات المهمة في سير العمل التجريبي حيث أن جودة الحمض
النووي المستعاد يمكن أن تؤثر على الأداء في تفاعلات المصب (downstream reactions). يمكن استخدام
مجموعة واسعة من التقنيات لتحويل عينة لا يمكن تحليلها مباشرة إلى عينة تتناسب مع متطلبات
التقنية التحليلية المراد استخدامها.
الأدوات والأساليب
المستخدمة في تحليل الحمض النووي
عزل الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ينطوي استخراج
الحمض النووي وتنقيته على ثلاث خطوات أساسية - كسر الخلايا المفتوحة لكشف الحمض النووي
، وخطوات - كسر الخلايا المفتوحة لكشف الحمض النووي ، وإزالة الدهون الغشائية من خلال
استخدام منظف مناسب وترسيب الحمض النووي بالكحول. هناك أيضًا خطوتان اختياريتان يتم
إجراؤهما دائمًا تقريبًا قبل خطوة الترسيب - إزالة البروتينات عن طريق إضافة بروتياز(protease, إنزيم يكسر البروتينات
والببتيدات.) مناسب وإزالة الحمض النووي الريبي(RNA) باستخدام (,Rnase إنزيم يعزز تحلل الحمض النووي
الريبي(RNA) إلى قليل النوكليوتيدات
وجزيئات أصغر).
يتم استرداد العينة
البيولوجية وحمايتها من مزيد من التدهور من خلال توفير بيئة باردة و / أو عن طريق إضافة
بيئة كيميائية خاصة. الهدف الرئيسي هو الحصول على جزيء DNA / RNA المنقى من المستخلصات المشتركة
(البروتينات ، الدهون ، ستيرويدات، إلخ). العينة النموذجية في الأقسام الطبية هي الدم
الطازج ، 3 مل من الدم يوفر التطبيق. 50ng / µl من DNA. كمية ونوعية الأحماض النووية المعزولة لها تأثير
كبير على جميع التحليلات النهائية.
يمكن قياس التركيز والنقاء بواسطة قياس الطيف الضوئي
(spectrophotometry). يمكن تقييم
طول جزيئات DNA / RNA على الرحلان الكهربائي (electrophoresis).
تستخدم تقنيات
استخراج الحمض النووي التقليدية مذيبات عضوية مثل الفينول كلوروفورم لفصل الأحماض النووية
من البروتينات والكربوهيدرات والحطام الخلوي الذي سيذوب في المرحلة المائية. يسمح الطرد
المركزي بعد ذلك بجمع الطبقة المحتوية على حمض نووي محبة للماء ، يليها ترسيب الكحول
لاستعادتها. إن التلاعب في الأس الهيدروجيني للمحلول وإضافة الإضافات المناسبة مثل
كحول isoamyl و guanidinium thiocyanate ، سيسمح بعزل الحمض النووي
الريبي أثناء تعطيل RNases.
مطلوب دائمًا خطوات غسيل كحول متعددة لإزالة مستويات عالية من الملح التي تؤثر على
تطبيقات المصب (ownstream applications).
تتخلص تقنيات استخلاص
الأحماض النووية التجارية إلى حد كبير من طرق الترسيب التي غالبًا ما تستغرق وقتًا
طويلاً لصالح استخراج المرحلة الصلبة بشكل شائع في شكل أعمدة دورانية. تعمل مصفوفات
السيليكا (silica matrices)
هذه وغيرها من مواد التبادل الأيوني على تغيير الانجذاب إلى الأحماض النووية مع تغيير
الأس الهيدروجيني ومحتويات الملح ، إلى جانب قوة الطرد المركزي ، وتدفق عمليات الاستخراج
المستندة إلى العمود تبسط إلى حد كبير مختلف خطوات الامتزاز(adsorption) والغسيل والتخلص (washing and elution) المطلوبة مما يؤدي إلى استخراج عالي الجودة
مجانًا من الملوثات ومناسبة لغالبية تطبيقات المصب
الرحلان الكهربائي
للحمض النووي (Nucleic acid
electrophoresis)
أصبحت تقنيات الرحلان
الكهربي (Electrophoretic)
وسيلة أساسية لتحليل وتوصيف جزيئات الحمض النووي المؤتلف. يتم استخدام كل من الاغاروز
(agarose, مادة هي المكون
الرئيسي للأجار" agar" وتستخدم بشكل خاص في المواد الهلامية للرحلان
الكهربائي. عديد السكاريد 'polysaccharide'الخطي. من الجالاكتوز
و 3.6- اللامائية هيدروجلاكتوز 'anhydrogalactose' ، مرتبطان بالترابط الهيدروجيني' hydrogen bonding') والمواد الهلامية
بولي أكريلاميد polyacrilamide لفصل الحمض النووي كهربائيا .
مبادئ الرحلان
الكهربائي
• يتم حل الجزيئات
على أساس الحجم (الكتلة أو الطول) ، والشكل أو التشكل ، وحجم الشحنة الصافية.
• عند قيم الأس
الهيدروجيني المحايدة ، بسبب مجموعات الفوسفات المتأينة (المشحونة بالسالب) للسكر الفوسفوري
(phosphor-sugar backbone) للحمض النووي
DNA والحمض النووي RNA، فإنها ستنتقل إلى القطب الموجب المسمى الأنيون
في المجال الكهربائي.
الحمض النووي المزدوج DNA لديهم تقريبًا نفس الشحنة الصافية إلى نسبة الكتلة وسوف ينتقل إلى الأنود
بسرعات متساوية.
• تؤثر اللزوجة
(درجة الارتباط المتبادل) للوسط على الاحتكاك ، وبالتالي يمكن استخدام الشكل الجزيئي
لفصل الأحماض النووية حسب الحجم. تتأثر السرعة بحجم الجزيء والمسام. وهي مستقلة إلى
حد ما عن تكوين القاعدة أو تسلسلها.
_ تركيز الأغاروز
(Agarose): 3-0.1٪
(70-800,000bp)
- بولي أكريلاميد (Polyacrilamide) : 20-30٪ (6-1000bp)
تصور جزيئات الحمض
النووي (Visualizing DNA molecules)
يتألق إيثيديوم
بروميد عندما يتم تعريضه للأشعة فوق البنفسجية بطول موجة 300nm. ويمكنه أيضًا أن يقارن بين القواعد المكدسة
لحمض DNA والحمضRNA. لا تلتزم الصبغة ببوليمرات الأغاروز أو بولي
أكريلاميد.
تتسبب الإضاءة
عند 254 نانومتر في تقطيع الصورة وتعتيمها وتبييضها السريع.
يُفضل المشاهدة
عند 302 نانومتر ، لكنها لا تعطي نفس حساسية 254 نانومتر للكشف عن نطاقات باهتة.
يجب حماية العينين
من الأشعة فوق البنفسجية في جميع الأوقات.
تتناسب شدة الفلورة(fluorescence, الإشعاع المرئي
أو غير المرئي المنبعث من مواد معينة نتيجة للإشعاع الساقط بطول موجة أقصر مثل الأشعة
السينية أو الأشعة فوق البنفسجية) بشكل مباشر مع حجم أجزاء الحمض النووي.
أصغر كمية من الحمض
النووي يمكن اكتشافها من أي فئة حجم أقل من 1 نانوجرام.
عندما يرتبط إثيديوم
بروميد(EtBr) بالحمض النووي الدائري ، فإنه يحول الدائرة
المريحة إلى جزيء ملفوف (supercoiled
molecule). بشكل عام ، يتم تقليل هجرة أجزاء الحمض النوويDNA بنسبة 10-15٪ بواسطة EtBr.
تضاف الصبغة مباشرة
إلى المنطقة العازلة إلى تركيز بين 0.5 و 1.0 ميكروغرام / مل.
EtBr هو مطهر قوي ومسرطن محتمل.
دائما ارتداء قفازات التلاعب بالهلام. لا تتخلص في الحوض.
التصوير الفوتوغرافي:
الصورة الرقمية , يستخدم transilluminator الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة لالتقاط الصور.
تتبع حل الصبغة
أو مزيج التوقف
يخدم ثلاث وظائف
مهمة:
- إنهاء التفاعلات الإنزيمية
- وسيلة ملائمة لتحميل العينات على الجل
- رصد تقدم الرحلان الكهربائي
يحتوي عادةً على:
- SDS أو اليوريا لإفساد البروتينات
- ficoll أو الجلسرين للزوجة
- صبغ مثل أزرق البروموفينول
علامات الحجم للجل
(Size markers for gels)
يستخدم بروموفينول
الأزرق كمؤشر حجم دقيق إلى حد ما لأجزاء الحمض النووي الصغيرة.
لتقدير الحجم الدقيق
، من الضروري أن يكون لديك مجموعة من أجزاء الحمض النووي ذات الحجم المعروف.
يهضم مع لامدا(lambda) أو pBR322 حيث يمكننا تحديد الحجم بدقة.
شروط الرحلان الكهربائي
(Electrophoresis)
·
تعمل في درجة حرارة
الغرفة (عادة لا يلزم التبريد)
·
في حالة حدوث ارتفاع
في درجة الحرارة ، يمكن تشويه نطاقات الحمض النووي.
·
الحرارة الزائدة
تعتمد على أبعاد الهلام(gel dimensions)
والتيار.
·
يعتمد تيار التشغيل
الأمثل على درجة الدقة وحجم القطعة والوقت. يجب تحقيق التوازن بين الحدة والانفصال.
·
ينطبق نفس الوضع
على طول الهلام وتركيز الهلام (gel length
and gel concentration).
تحويل RNA الى cDNA
تفضل العديد من
الأساليب التحليلية DNA بدلاً من جزيئات RNA.
لهذا السبب ، يمكن تحويل جزيئات الحمض النووي الريبي الفردية التي تقطعت بها السبل
(إجمالي RNA ، rRNA ، mRNA ، وما إلى ذلك) إلى جزيء cDNA مزدوج الحمض النووي (DNA التكميلي) عن طريق انزيم النسخ
العكسي (reverse transcriptas)
، وهو إنزيم نموذجي في علم الأحياء الفيروسي.
تفاعل البلمرة
المتسلسل PCR (polymerase chain reaction)
تفاعل البوليميراز
المتسلسل - تفاعل البلمرة المتسلسل - يحاكي هذا الأسلوب في المختبر العمليات الفسيولوجية
أثناء مرحلة التكاثر لدورة الخلية. يسمح للباحثين بنسخ جزء معين أو عدة أجزاء من الحمض
النووي مما يجعلهم أكثر وفرة في العينة وبالتالي يمكن تحليلها. بمجرد إثراء العينة
بشظايا مناطق محددة ، تميز جميع طرق المصب فقط قطعة الحمض النووي المختارة المختارة.
يمكن أن تركز على التواجد (قياس نوعي) ، الطول (يمكن أن يحدد الطول المحدد أليل) ،
تكوين النوكليوتيدات (التسلسل ، التقييد ، السلوك المختلف في ذوبان الشريط المزدوج)
، إلخ ...
تفاعل البوليميراز المتسلسل بالزمن الحقيقيqPCR
تفاعل البوليميراز
المتسلسل بالزمن الحقيقي أو تفاعل البوليميراز المتسلسل اللحظي(real-time polymerase chain reaction)
ويسمى أيضا تفاعل البوليميراز المتسلسل ألكمي اللحظي (quantitative real time polymerase chain reaction) أو أيضا تفاعل
البوليمراز المتسلسل الحركي، يجمع بين تضخيم
مقطع DNA معين مع الكشف الفلوري المتزامن
للمنتج الناتج. تسجل الأداة نمو إشارة الفلورة (fluorescence signal) في كل دورة وبالتالي معدل إنتاج منتج PCR. من خلال مراقبة التفاعل خلال المرحلة الأسية
(exponential phase) ، يمكن تحديد
الكمية الأولية لجزء الحمض النووي المستهدف.
التسلسل (Sequencing)
تم الكشف عن تكوين
النيوكليوتيد للجزء المضخم من PCR من خلال مبدأين أساسيين.
طريقة سانجر(Sanger method)
طريقة Sanger هي طريقة إنهاء السلسلة التي
تستخدم مكونات PCR الكلاسيكية بالإضافة إلى dideoxynucleotides المعدلة كيميائيًا (4 أصباغ
الفلورسنت " fluorescent
dyes" المختلفة لكل قاعدة) من تلك التي تم دمجها
مرة واحدة ، لا يمكن للبوليميراز أن ينتشر لإضافة نوكليوتيد آخر. جميع الأطوال الممكنة
(قاعدة التمهيدي" primer" + 1 حتى آخر نيوكليوتيد من التسلسل المضخم)
يتم إجراؤها أثناء تسلسل PCR ثم يتم فصلها وفقًا لطولها عن طريق الرحلان الكهربائي" electrophoresis " ، وهي قادرة على قراءة إشارة الفلورسنت" fluorescent signal " لكل جزء.
تسلسل الجيل التالي(Next-generation sequencing NGS)
تعدد شكل طول جزء
الحصر RFLP
(restriction fragment length
polymorphism)
إن إنزيمات الاقتطاع أو إنزيمات القطع أو
الإنزيمات القاطعة أو إنزيمات التقييد (Bacterial endonucleases)الموجودة في البكتريا قادرة على قطع
حبلا الحمض النووي في منطقة محددة محددة بتسلسل قصير للحمض النووي (بنية متناظرة -
تسلسل يقرأ نفسه من كلا الجانبين ، على سبيل المثال: ACCA). يمكن أن يسبب استبدال النيوكليوتيد ظهور /
اختفاء موقع التقييد. يمكن أن يخدم هذا النهج فحصًا شائعًا لاكتشاف الطفرات ، أو كأداة
في تحليل الحمض النووي غير المباشر. منذ وقت طويل ، بعد أن تم هضم الحمض النووي عن
طريق نوكلياز تقييد محدد (restriction
endonuclease) ، تم بعد ذلك فصل الشظايا الناتجة عن طريق الرحلان
الكهربائي(electrophoresis)
، ونقلها إلى الغشاء (اللطخة الجنوبية"
Southern blot", هي عبارة عن طريقة تستخدم في البيولوجيا الجزيئية
للكشف عن حمض نووي في عينة حمض نووي معينة.) ، وتصور باستخدام مسبار مسمى (labelled probe).
اللطخة الجنوبية
أو لطخة
ساوثيرن (Southern
blot)
اللطخة الجنوبية
- هو نقل شظايا DNA مفصولة بواسطة الرحلان الكهربائي
(electrophoresis)
على الغشاء. يتيح النقل على الغشاء مزيدًا من التلاعب ، خاصة التهجين باستخدام المسبار
المسمى(labelled probe).
أساليب أخرى
تم تطوير مجموعة
متنوعة من الأساليب:
التشكيل الكهربائي
للهلام المتدرج بدرجة الحرارة والتشريد الكهربائي للهلام المتدرج في درجة الحرارة" Denaturing gradient gel electrophoresis DGGE "
و جل كهربائي متدرج لدرجة الحرارة Temperature gradient gel electrophoresis TGGE
و ممارس أمن النظم
المعتمد The Systems Security
Certified Practitioner SSCP
و التحليل المتغاير HDA
Heteroduplex Analysis و تحليل منحنى الانصهار Melting Curve Analysis وغيرها) للكشف عن متغيرات غير
معروفة في أجزاء DNA مختارة (منتجات PCR).
تستخدم هذه الطرق الاختلاف في الخواص الكيميائية أو الفيزيائية لأجزاء الحمض النووي
التكميلية المزدوجة الجدائل على أجزاء الحمض النووي مزدوجة الخيوط مع عدم التطابق ،
أو شظايا الحمض النووي أحادية الشريط المحورة ضد أجزاء الحمض النووي غير المتحولة.
يتم تحويل الفرق إلى حركة مختلفة لجزء DNA في جل بولي أكريلاميد. تعتمد تقنيات الكشف عن عمليات الحذف / الازدواجية
غير المتوازنة التي لا يمكن استردادها عن طريق التنميط النووي الكلاسيكي على حقيقة
أن DNA يتهجن إلى نظيره التكميلي كلما
تقطعت به السبل وفي بيئة مناسبة (درجة الحرارة ، القوة الأيونية). تتضمن هذه الطرق
التهجين الجيني المقارن (CGH)
، أو تضخيم المسبار المعتمد على الربط المتعدد (MLPA) ، أو PCR في الوقت الحقيقي (qPCR).
تقنيات الكشف عن
الانحرافات الهيكلية المتوازنة ذات النطاق الأصغر (التي يصعب الكشف عنها عن طريق التنميط
النووي الكلاسيكي) أقل وفرة ، حيث تركز معظم التقنيات الجزيئية على القياسات الكمية.
التهجين المسمى بالفلوريسنت في الموقع (FISH)
أو التهجين متعدد الألوان (mFISH)
- يتم تهجين تحقيقات متعددة تحمل علامات الفلورسنت إلى الكروموسومات المكثفة ويجب أن
يتكون الكروموسوم النهائي متعدد الألوان من صورة نطاق ألوان محددة.
التنميط النووي
(karyotyping)
الطريقة الكلاسيكية
لأقسام الوراثة الخلوية. هو اختبار لفحص الكروموسومات في عينة من الخلايا. يمكن أن
يساعد هذا الاختبار في تحديد المشاكل الجينية كسبب لاضطراب أو مرض. يتم استغلال العملية
الطبيعية لتكثيف الكروموسومات أثناء تكاثر الخلايا في هذه الطريقة لتصور أجسام الكروموسومات
في المجهر الضوئي. يساعد التعرف على نمط ربط محدد في تحديد كل زوج كروموسومي وتقييم
الانحرافات العددية أو التركيبية المحتملة.
الاستنساخ (Cloning)
هو عملية أخذ المعلومات
الجينية من كائن حي واحد وإنشاء نسخ متطابقة منها.
الحمض النووي لكائن غير معروف مجزأ مع إنزيم تقييد
ثم يتم استنساخه في ناقلات البلازميد(plasmid
vector) وتضخيمه(amplified). يمكن قراءة الجينومات الجديدة من خلال مجموعات
من التتابعات المتداخلة ، ما يسمى contigs (من كلمة"
contiguous"
"متجاورة" - هي سلسلة من تسلسلات الحمض النووي المتداخلة المستخدمة لعمل خريطة فيزيائية تعيد بناء تسلسل الحمض النووي
الأصلي للكروموسوم أو منطقة الكروموسوم. يمكن أن يشير contig أيضًا إلى أحد تسلسلات DNA المستخدمة في صنع مثل هذه الخريطة)
.
أجهزة استشعار
النانو(Nanopore sensors)
لتحليل الحمض النووي
يعد الاستشعار
القائم على النانو جذابا لتطبيقات تسلسل الحمض النووي لأنه نهج خالٍ من الملصقات (label) وخالي من التضخيم (amplification) وجزيء واحد يمكن تحجيمه (scaled) لتحليل الحمض النووي عالي الإنتاجية. علاوة
على ذلك ، تتطلب عادةً كميات منخفضة من الكواشف (reagent) ، وتستفيد من تكلفة منخفضة نسبيًا وتدعم أطوال
القراءة الطويلة (long read lengths)
، لذلك يمكن أن تتيح تسلسل دي نوفو (de novo)
ورسم خرائط نمطية طويلة المدى. يتشابه مبدأ استشعار المسام النانوية مع مبدأ استشعار
كولتر (Coulter counter).
يتم تشكيل فتحة مقياس النانو (the
nanopore,ثقب النانو) في غشاء عازل يفصل بين غرفتين مليئة
بالكهرباء الموصلة.
يتم دفع الجزيئات
المشحونة عبر المسام تحت جهد كهربائي مطبق (عملية تعرف باسم الرحلان الكهربائي) ، وبالتالي
تعديل التيار الأيوني من خلال المسام النانوي. يكشف هذا التيار معلومات مفيدة حول بنية
الجزيء وحركته الديناميكية. الفكرة الأساسية هي أنه عندما يمر خيط واحد من الحمض النووي
عبر المسام النانوي ، يعتمد التيار الأيوني المتبقي على النوكليوتيد أو القاعدة (الأدينين
(أ) أو السيتوزين (ج) أو الجوانين (ز) أو الثيمين (ت)) في تقب النانو في ذلك الوقت.
لذلك ، من خلال
تسجيل كيفية تغير التيار الأيوني من خلال المسام النانوية مع مرور الوقت ، يجب أن يكون
من الممكن تحديد تسلسل القواعد في جزيء DNA.
باستخدام هذا الإطار العام ، أثبتت تجارب إثبات المبدأ باستخدام اثنتين من المسام النانوية
الطبيعية أو البيولوجية - α-haemolysin و Mycobacterium
smegmatis porin A (MspA) - أن تسلسل الحمض النووي القائم على nanopore ممكن بالفعل. تتمثل التحديات
الرئيسية في هذا المجال في تقليل السرعة التي يمر بها جزيء الحمض النووي أو ينتقل عبر
المسام النانوي وتحسين حساسية النهج ، الأمر الذي سيتطلب أساليب استشعار جديدة وهندسة
أجهزة جديدة. التحدي الآخر هو حقيقة أن تيارات الأنفاق تختلف بشكل كبير مع كل من عرض
وارتفاع الحواجز التي يجب أن تمر عبرها الإلكترونات ، والتي تعتمد بدورها على مسافة
النفق الفعالة وعلى اتجاه الجزيء. وبالتالي ، يمكن أن يكشف قياس المسبار رباعي النقاط
(four-probe)
عن معلومات أكثر بكثير من القياسات ذات المسبارين التي تمت محاولتها حتى الآن ، ولكن
تصنيع هيكل من أربعة مجسات(four-probe)
بشكل موثوق به بدقة تحت القياس الجزئي سيكون تحديًا هائلًا. وتجدر الإشارة أيضًا إلى
أنه ليس من الضروري تحديد جميع القواعد الأربعة لتطبيقات معينة بشكل فريد. استخدم بعض
الباحثين تحويلًا ثنائيًا لتسلسل النوكليوتيدات (A أو T = 0 ، و G أو C = 1) ، لاكتشاف المؤشرات الحيوية وتحديد التغيرات
الجينومية في أجزاء قصيرة من DNA و RNA.
على مدى السنوات القليلة الماضية ، كانت كل من المسام النانوية البيولوجية والحالة
الصلبة تقترب من هدف التسلسل المباشر الخالي من الملصقات لجزيئات DNA في الوقت الفعلي. ليس هناك
شك في أن أجهزة الاستشعار القائمة على النانو ستستمر في التطور كمرشحين أقوياء للانضمام
إلى تقنيات تسلسل الجيل الثالث الأخرى في السباق نحو تسلسل الحمض النووي الميسور والشخصي.
المــــراجع:
- Donna C. Sullivan,'Isolation and Purification of Nucleic Acids',2015.Retrieved
- Methods of nucleic acid analysis.(2011-Nov-15).Retrieved
from
https://www.wikilectures.eu/w/Methods_of_nucleic_acid_analysis
- Nucleic Acid Purification.(2020-April-1).Retrieved from
- Nucleic acid electrophoresis.(2020-jun-14).Retrieved from
- Venkatesan, B. M., & Bashir, R. (2011). Nanopore sensors for nucleic acid analysis. Nature nanotechnology, 6(10), 615-624.
 الأحماض النووية ( nucleic acids ) هي بوليمرات حيوية موجودة في جميع الكائنات الحية ، حيث ت…){kind=link}
تعليقات
إرسال تعليق